摘要：菌種是主要的生物資源，一個(gè)優(yōu)良的菌種被選育出來以后，必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產(chǎn)性能，能長期在生產(chǎn)中使用。MVE液氮罐

本文介紹了常用的微生物菌種的保藏方法:斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、沙土管保藏法、冷凍真空干燥保藏法、液氮超低溫保藏法和基因工程菌的保藏，并比較了它們的優(yōu)缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：微生物;菌種;保藏

菌種是一個(gè)國家的重要自然資源，菌種保藏工作是一項(xiàng)重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作，菌種保藏工作者的任務(wù)是把從自然界分離得到的野生型或經(jīng)人工選育得到的用于科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)等方面的優(yōu)良菌種、菌株，用各種適宜的方法妥善保存，使之達(dá)到不死、不衰、不變異、不污染，在長時(shí)間內(nèi)保持原有的生產(chǎn)性狀和生命活力，以便于科學(xué)研究和生產(chǎn)使用。

1、保藏菌種用培養(yǎng)基

為了有效地保藏微生物菌種，首先需要有良好的培養(yǎng)基。因此，研究選用適宜的培養(yǎng)基是微生物菌種保藏最基本的工作。例如，ATCC(美國的一個(gè)微生物菌種保藏機(jī)構(gòu))在1970年以前采用的培養(yǎng)基有498種，1974年有724種，1978年達(dá)到1006種，平均每年增加60多種。

2、微生物菌種保藏的基本原理

人們在長時(shí)間的工作實(shí)踐中，根據(jù)微生物的不同要求，在菌種保藏工作中不斷摸索出各種方法。無論何種保藏方法，主要是根據(jù)微生物生理、生化特點(diǎn),人工創(chuàng)造條件,使微生物的代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工造成的環(huán)境主要是低溫、干燥、缺氧三者,此種條件,可使菌株很少發(fā)生突變以達(dá)到保持純種的目的。

3、微生物菌種的保藏方法

3.1　斜面低溫保藏法

將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至4～6℃的冰箱中保藏。

保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2～4個(gè)月，移種一次。酵母菌兩個(gè)月，細(xì)菌最好每月移種一次。斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對照，防止因意外和污染造成損失。

此法的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度影響其保藏質(zhì)量。培養(yǎng)時(shí)間過短，保存時(shí)容易死亡，培養(yǎng)時(shí)間長，生產(chǎn)性能衰退。成熟進(jìn)行保藏，效果較好。

優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，能隨時(shí)檢。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀;污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多。

3.2　液體石蠟保藏法

亦稱礦物油保藏法，定期移植保藏法的輔助方法。

(1)液體石蠟的準(zhǔn)備:選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進(jìn)行滅菌:①121℃濕熱滅菌30min，置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。②160℃干熱滅菌2h，冷卻后，經(jīng)無菌檢查后備用。

(2)斜面培養(yǎng)物的制備:將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。

(3)灌注石蠟:用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。

(4)保藏:將試管直立，置低溫(4～6℃)干燥處或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1～2年，一般無芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個(gè)月之久。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種。缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。

3.3　濾紙保藏法

(1)將濾紙剪成0.5cm×1.2cm的小條，裝入0.6cm×8cm的安瓿管中，每管1～2張，塞以棉塞，121℃滅菌30min。

(2)養(yǎng)1～2mL滴加在滅菌培養(yǎng)皿，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。

(4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

(5)將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。

(6)將棉花塞入管內(nèi)，用火焰熔封管口，保存于低溫下。

(7)需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。

細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14～17年之久。此法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。

3.4　沙土保藏法

(1)取河沙加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30min，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。

(2)倒去酸水，用自來水沖洗至中性。

(3)烘干，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。

(4)另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅的時(shí)間還要長)。保藏時(shí)間2～10年。保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充無菌的液體石蠟。

(5)恢復(fù)培養(yǎng):恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。

此法實(shí)用而效果好。霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。

(5)烘干，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。

(6)按一份黃土、三份沙的比例(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻，裝入10mm×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右，塞上棉塞，121℃濕熱滅菌30min，烘干。

(7)進(jìn)行無菌檢查，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗(yàn)，直至證明無菌，方可備用。

(8)選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的，營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。

(9)每支沙土管中加入約0.5mL(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液，以接種針拌勻。

(10)放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時(shí)間越短越好，務(wù)使在12h內(nèi)抽干。

(11)每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。

(12)若經(jīng)檢查沒有問題，，箱或室內(nèi)干燥處保存。情況。

(13)需要使用菌種，，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。

此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣，效果亦好，可保存2年左右，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。

3.5　冷凍真空干燥保藏法

(1)安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí)，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15～20min，備用。

(2)準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，若用對數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24～48h的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng)3d;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7～10d。

(3)制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，和脫脂牛乳2mL左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2mL。

(4)冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2)酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4～5min，即可使懸液結(jié)冰。

(5)將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時(shí)間一般為8～20h。

(6)將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

(7)保藏:安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。

(8)質(zhì)量檢查:冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。

(9):酒精棉花擦拭安瓿上部，在頂部，用挫刀或鑷子頸部輕叩一，，用無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進(jìn)行適溫培養(yǎng)。

此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無芽孢菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。

3.6　液氮冷凍保藏法

(1)用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈，121℃下高壓滅菌15～20min，備用。

(2)保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度，一般采用10%～20%甘油。

(3)微生物不同的生理狀態(tài)對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。

菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法:①刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)。②接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護(hù)劑混合分裝于凍存管內(nèi)。③將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5～10mm)，真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi);在小安瓿管中裝1.2～2mL的瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2～10d后，加入保護(hù)劑，待保藏。

(4)預(yù)凍時(shí)一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結(jié)到-35℃。

(5)保藏:將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。

(6)復(fù)蘇方法:從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置在38～40℃水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，一般約需50～10s。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。

3.7　基因工程菌的保藏

3.7.1　穿刺保藏法

使用容量為2～3mL并帶有螺口旋蓋和橡皮墊圈的玻璃小瓶，加入相當(dāng)于約2/3脂，旋上蓋子，但并不擰緊，min。，冷卻至室溫后擰緊蓋子。

保藏細(xì)菌時(shí)，用一滅菌的接種針挑取良好的單菌落，把針穿過瓊脂直達(dá)瓶底數(shù)次，蓋上瓶蓋并擰緊，在瓶身和瓶蓋上均做好標(biāo)記，室溫下存放于暗處。(更加廣為接受的做法是將瓶蓋放松，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)過夜，然后擰緊瓶蓋并加封膜，最好于4℃或于室溫避光保藏。

穿刺法可保藏細(xì)菌2年之久。

3.7.2　甘油管冷凍保藏

(1)在液體培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌培養(yǎng)物的保藏取細(xì)菌培養(yǎng)物，加入滅菌甘油(甘油應(yīng)在1.034×105Pa高壓下蒸汽滅菌20min)振蕩培養(yǎng)物使甘油分布均勻，然后轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的、帶有螺口和空氣密封圈的保存管內(nèi)，在乙醇-干冰或液氮中凍結(jié)后轉(zhuǎn)至-70℃長期保存。復(fù)蘇菌種時(shí)，用滅菌的接種針刮拭凍結(jié)的培養(yǎng)物表面，然后立即把粘附在接種針上的細(xì)菌劃于含適當(dāng)抗生素的LB瓊脂平板表面，凍干保存的菌種管重置于-70℃，而瓊脂平板于37℃培養(yǎng)過夜。

(2)在瓊脂平板上生長的細(xì)菌培養(yǎng)物的保存

從瓊脂平板表面刮下細(xì)菌放入裝有2mLLB的無菌試管內(nèi)，再加入等量的含有30%滅菌甘油的LB培養(yǎng)基，振蕩混合物使甘油完全分布均勻后，分裝于帶有螺口蓋和空氣密封圈的無菌試管中，按上述方法冰凍保存。

甘油管冷凍保藏法可保藏10年以上，若實(shí)驗(yàn)室不具備-70℃冰箱，也可把菌種放入-20℃冰箱中保藏，可保藏1年左右。

4、 總結(jié)

最好是每株菌種都采用兩種以上的保藏方法，并根據(jù)保藏菌種的保質(zhì)期，每隔一定時(shí)間，進(jìn)行入藏菌種的復(fù)活檢驗(yàn)和更新。MVE液氮罐